腺病毒
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腺病毒(adenovirus)是一種沒有包膜的直徑為70～90 nm的顆粒，由252個殼粒呈廿面體排列構(gòu)成。每個殼粒的直徑為7～9 nm。衣殼里是線狀雙鏈DNA分子，約含35 000 bp，兩端各有長約100 bp的反向重復(fù)序列。由于每條DNA鏈的5'端同相對分子質(zhì)量為55X103Da的蛋白質(zhì)分子共價結(jié)合，可以出現(xiàn)雙鏈DNA的環(huán)狀結(jié)構(gòu)。
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腺病毒簡介
人體腺病毒已知有33種，分別命名為adl～ad33，研究得最詳細(xì)是ad2。腺病毒基因組轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生mRNA，已知的轉(zhuǎn)錄單位至少有5個：EⅠ區(qū)位于病毒基因組左側(cè)，可再分成EⅠA和EⅠB，與細(xì)胞轉(zhuǎn)化有關(guān)；EⅡ區(qū)編碼DNA結(jié)合蛋白，參與病毒的復(fù)制；EⅢ區(qū)編碼出現(xiàn)在宿主細(xì)胞表面的一種糖蛋白；EⅣ區(qū)位于ad2基因組右端，受EⅡ區(qū)編碼的DNA結(jié)合蛋白質(zhì)調(diào)控；第5個轉(zhuǎn)錄單位在病毒感染中期合成ad2蛋白質(zhì)Ⅳ。
腺病毒對嚙齒類動物有致癌能力，或能轉(zhuǎn)化體外培養(yǎng)的嚙齒類動物細(xì)胞。使細(xì)胞轉(zhuǎn)化只需要腺病毒基因組的一部分，這些基因位于基因組的左端，約占整個基因組的7％～10％。盡管腺病毒分布很廣，但對人體不出現(xiàn)致癌性。人體細(xì)胞是一類允許細(xì)胞(permissive cell)，即這類細(xì)胞允許感染入侵的病毒在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制增殖，最后細(xì)胞裂解死亡而釋放出大量子代病毒。在體外培養(yǎng)的多種人體腫瘤細(xì)胞中均未查出腺病毒顆粒，但在人的1號染色體上有adl2的整合位點，這意味著人體細(xì)胞對于腺病毒也可能是非允許細(xì)胞，即這類細(xì)胞在病毒感染后，病毒不能在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制增殖，但可整合在受感染細(xì)胞的基因組內(nèi)。這些細(xì)胞被病毒轉(zhuǎn)化，表型發(fā)生改變，且可在體外無限期地培養(yǎng)傳代。
腺病毒是一種無外殼的雙鏈DNA病毒，基因組長約36kb，衣殼（capsid）呈規(guī)則的20面體結(jié)構(gòu)，直徑約80-110nm。衣殼含有240個聯(lián)體（hexon）、12個聯(lián)體（penton）及12根纖毛（fiber），除此之外還有其他一些小蛋白，如VI、VIII、IX、IIIa和IVa2等。六聯(lián)體是形成病毒衣殼20個三角形面的主要蛋白，12個頂端是5個聯(lián)體亞單位和3個纖毛蛋白構(gòu)成的復(fù)合物，12根纖毛以五聯(lián)體蛋白為基底由衣殼表面伸出，纖毛頂端形成頭節(jié)區(qū)（knob）。五聯(lián)體和纖毛的頭節(jié)區(qū)可與細(xì)胞表面的病毒受體結(jié)合，在病毒感染細(xì)胞過程中起著非常重要的作用。腺病毒的基因組以線性的雙鏈DNA形式存在，由蛋白VII和一種稱為mu的小蛋白緊密地環(huán)繞在其周圍，起到類組蛋白樣的作用。另一種蛋白V將這種DNA-蛋白復(fù)合物連接起來，并通過蛋白VI與病毒衣殼連接在一起。在兩條鏈的5′端各以共價鍵結(jié)合著一個被稱為DNA末端蛋白（pTP）復(fù)合物（DNA-TPC）的特化的結(jié)構(gòu)，與腺病毒復(fù)制密切相關(guān)。腺病毒基因組的兩端各有一段100bp的反向末端重復(fù)序列（ITR），是復(fù)制的起始位點。在左端ITR的3′側(cè)有一段長約300bp的包裝信號（ψ）介導(dǎo)腺病毒基因組包裝入病毒衣殼。對腺病毒而言，只有包括兩端的ITR和包裝信號（ψ）的約0.5kb的序列是順式作用元件，也就是說必須由腺病毒載體自身攜帶，而其他的30余種蛋白都可以通過輔助病毒（或細(xì)胞）反式補足。
腺病毒載體的優(yōu)點
1. 宿主范圍廣, 對人致病性低
腺病毒載體系統(tǒng)可廣泛用于人類及非人類蛋白的表達。腺病毒可感染一系列哺乳動物細(xì)胞，因此在大多哺乳動物細(xì)胞和組織中均可用來表達重組蛋白。特別需要指出的是：腺病毒具有嗜上皮細(xì)胞性，而人類的大多數(shù)的腫瘤就是上皮細(xì)胞來源的。另外，腺病毒的復(fù)制基因和致病基因均已相當(dāng)清楚，在人群中早已流行（70-80%成人體內(nèi)都有腺病毒的中和抗體存在）。人類感染野生型腺病毒后僅產(chǎn)生輕微的自限性癥狀，且病毒唑治療有效?！ ?/p>
2. 在增殖和非增殖細(xì)胞中感染和表達基因
逆轉(zhuǎn)錄病毒只能感染增殖性細(xì)胞，因此DNA轉(zhuǎn)染不能在非增殖細(xì)胞中進行，而必須使細(xì)胞處于持續(xù)培養(yǎng)狀態(tài)。腺病毒則能感染幾乎所有的細(xì)胞類型，除了一些抗腺病毒感染的淋巴瘤細(xì)胞。腺病毒是研究原代非增殖細(xì)胞基因表達的最佳系統(tǒng)，它可以使轉(zhuǎn)化細(xì)胞和原代細(xì)胞中得到的結(jié)果直接進行對比。
3. 能有效進行增殖，滴度高
腺病毒系統(tǒng)可產(chǎn)生1010到1011VP/ml，濃縮后可達1013VP/ml，這一特點使它非常適用于基因治療?！ ?/p>
4. 與人類基因同源
腺病毒載體系統(tǒng)一般應(yīng)用人類病毒作為載體，以人類細(xì)胞作為宿主，因此為人類蛋白進行準(zhǔn)確的翻譯后加工和適當(dāng)?shù)恼郫B提供了一個理想的環(huán)境。大多數(shù)人類蛋白都可達到高水平表達并且具有完全的功能?！ ?/p>
5. 不整合到染色體中，無插入致突變性
逆轉(zhuǎn)錄病毒可隨機整合到宿主染色體，導(dǎo)致基因失活或激活癌基因。而腺病毒則除了卵細(xì)胞以外幾乎在所有已知細(xì)胞中都不整合到染色體中，因此不會干擾其它的宿主基因。在卵細(xì)胞中整合單拷貝病毒則是產(chǎn)生具有特定特征的轉(zhuǎn)基因動物的一個較好的系統(tǒng)?！ ?/p>
6. 能在懸浮培養(yǎng)液中擴增
293細(xì)胞可以適應(yīng)懸浮培養(yǎng)，這一調(diào)整可使病毒大量擴增。大量事實證明懸浮293細(xì)胞可在1～20L的生物反應(yīng)器中表達重組蛋白。
7. 能同時表達多個基因
這是第一個可以在同一細(xì)胞株或組織中用來設(shè)計表達多個基因的表達系統(tǒng)。最簡單的方法是將含有兩個基因的雙表達盒插入腺病毒轉(zhuǎn)移載體中，或者用不同的重組病毒共轉(zhuǎn)染目的細(xì)胞株來分別表達一個蛋白。測定不同重組病毒的MOI比值可正確估計各重組蛋白的相對共表達情況。
正是由于具有以上一些優(yōu)點，腺病毒被極其廣泛地應(yīng)用于體外基因轉(zhuǎn)導(dǎo)、體內(nèi)接種疫苗、和基因治療等各個領(lǐng)域。
分類及致病性
分類及自上個世紀(jì)50年代發(fā)現(xiàn)并成功分離腺病毒以來，已陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了100余個血清型，其中人腺病毒有47種，分為A、B、C、D、E和F六個亞群（subgroup）。基因治療常用的人的2型及5型腺病毒在血清學(xué)分類上均屬C亞群，在DNA序列上有95%的同源性。二者的增殖能力非常強，滴度通?？梢赃_到109pfu (plaque forming unit)/ml，其在單個細(xì)胞中的基因組拷貝數(shù)可達104（約占細(xì)胞總DNA的10%）。病毒顆粒比較穩(wěn)定，通過CsCl梯度離心可以達到1010~1011pfu/ml，滿足動物實驗的要求。
2型和5型腺病毒的致病性主要表現(xiàn)為可以導(dǎo)致兒童上呼吸道感染。在感染的最初幾天，由于病毒大量復(fù)制和釋放，會出現(xiàn)中度發(fā)熱、渾身酸痛、乏力、咽痛等癥狀。但這些癥狀通常是比較短暫而輕微的，在以后的幾天里，會隨著中和抗體的產(chǎn)生而逐漸消失。雖然可以說高滴度和高免疫原性是腺病毒的主要特點，但也是相對的，如8型腺病毒（主要感染小腸和結(jié)膜組織）可以在扁桃體等淋巴組織中潛伏下來。在C亞群的其他一些腺病毒中也可以見到同樣的現(xiàn)象，這是因為病毒的E3區(qū)編碼的功能可使其逃避宿主的免疫打擊。這似乎有助于理解為何腺病毒載體在造血系細(xì)胞中的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)效率明顯低于其他組織、細(xì)胞?！ ?/p>
腺病毒的生活周期
腺病毒的生活周期可以分為兩個截然不同卻又不能割裂開來的兩個階段。第一階段包括腺病毒顆粒粘附和進入宿主細(xì)胞，將基因組釋放到宿主細(xì)胞核中，以及有選擇性地轉(zhuǎn)錄和翻譯早期基因。在這個階段，細(xì)胞為病毒基因組復(fù)制和腺病毒晚期基因表達并最終釋放成熟的感染顆粒，即第二階段，作好了準(zhǔn)備。第一階段將在6~8個小時內(nèi)完成，第二階段則更快，只需4~6個小時。
粘附和進入細(xì)胞
腺病毒感染細(xì)胞的過程是從腺病毒纖毛的頭節(jié)區(qū)粘附到細(xì)胞表面的特異性受體開始的。因為人腺病毒主要與柯薩奇B病毒共用一種受體，因此這種受體被稱為柯薩奇/腺病毒受體即CAR（coxsackie/adenovirus receptor）。接下來病毒纖毛基底部五鄰體表面的三肽RGD與細(xì)胞表面的αvβ3和αvβ5整合素結(jié)合，通過內(nèi)吞作用將腺病毒內(nèi)化到細(xì)胞中并進入溶酶體。在溶酶體的酸性環(huán)境下，腺病毒衣殼的構(gòu)象將發(fā)生變化，被從溶酶體中釋放出來，躲過溶媒體的消化作用。最后，腺病毒顆粒轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核，通過核孔將病毒DNA釋放到細(xì)胞核內(nèi)。相對于脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染，腺病毒基因組進入細(xì)胞核是一個非常高效的過程，一般可以達到40%，前者雖然進入胞質(zhì)的效率與后者相當(dāng)，而DNA進入細(xì)胞核的效率卻只有前者的1/1000?！ ?/p>
轉(zhuǎn)錄與復(fù)制
一旦病毒基因組進入細(xì)胞核，就將進行一系列的復(fù)雜而有序的逐級放大的剪切和轉(zhuǎn)錄過程。一般的，以病毒DNA開始復(fù)制為分界線，按轉(zhuǎn)錄時間的先后，將腺病毒基因大致區(qū)分為早期（E1~4）和晚期轉(zhuǎn)錄單位（L1~5）。各種腺病毒基因又可以進一步地分為更小的轉(zhuǎn)錄單位，如E1區(qū)可以進一步分為E1A和E1B，每個轉(zhuǎn)錄單位都至少有一個獨特的啟動子。腺病毒基因組進入細(xì)胞核后，細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子首先與E1A區(qū)上游的增強子結(jié)合，表達E1A蛋白，該蛋白的作用是調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝，使病毒DNA更易于在細(xì)胞中復(fù)制。E1A蛋白還可以激活其他早期基因（E1B、E2A、E2B、E3和E4）的啟動子，其中E2B驅(qū)動另外三個與病毒復(fù)制有關(guān)的早期基因轉(zhuǎn)錄單位末端蛋白前體（pTP, precursor terminal protein）、單鏈DNA結(jié)合蛋白（ssDBP, single-stranded DNA binding proteins）以及DNA聚合酶（DNA pol, DNA polymerase）的表達，這三個基因的表達產(chǎn)物緊密地結(jié)合成一個復(fù)合物，與至少三種細(xì)胞蛋白相互作用，啟動病毒基因組的復(fù)制。
一般而言，DNA的復(fù)制是由RNA啟動的，而在腺病毒卻是所謂的蛋白啟動（protein-priming）。如前所述，腺病毒雙鏈DNA的每條單鏈的5′端有pTP蛋白結(jié)合，pTP通過其Ser-OH與DNA 5′端的dCMP 5′磷酸之間形成磷酸二脂鍵。腺病毒的DNA復(fù)制首先是以5′端結(jié)合有pTP的dCMP作為引物，以3′端的末端反向重復(fù)序列（ITR）為模板，進行鏈置換（strand displacement）合成，置換出的單鏈分子可以自我退火環(huán)化，形成鍋柄樣環(huán)形分子，然后這種環(huán)形分子再以相同的機制合成出子代雙鏈DNA分子。
病毒基因組復(fù)制通常在感染后數(shù)小時開始，同時早期基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯被關(guān)閉，晚期基因開始表達。大部分的晚期基因的轉(zhuǎn)錄是以一個共同的主要晚期啟動子（MLP, Major Late Promoter）調(diào)控的。實際上，MLP的活性與病毒基因組復(fù)制密切相關(guān)，有研究表明一旦腺病毒基因組開始復(fù)制MLP的活性將明顯增強，對此我們將另外行文詳述。晚期基因主要編碼腺病毒的結(jié)構(gòu)蛋白。病毒結(jié)構(gòu)蛋白在細(xì)胞核內(nèi)聚集形成病毒衣殼，病毒的基因組被包裝進去，形成有感染能力的病毒顆粒，并最終裂解宿主細(xì)胞被釋放出去，完成腺病毒的生活周期。腺病毒有明顯的種屬特異性，人的野生型5型腺病毒（wtAd
5）感染其他的非人類細(xì)胞（如鼠類細(xì)胞）后可以表達早期基因，基因組也可有一定程度的復(fù)制并能夠形成一些不成熟的病毒顆粒，卻不能形成成熟的病毒顆粒，也不能二次感染其他細(xì)胞?！ ?/p>
腺病毒基因產(chǎn)物的主要功能
E1區(qū)基因表達產(chǎn)物
可以進一步分為E1A和E1B。E1A主要由兩種成分構(gòu)成，分別為289R（或13S）和243R（或12S）。這些E1A蛋白的主要功能是調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝，使細(xì)胞對病毒復(fù)制更易感E1B19K與細(xì)胞Bcl-2基因的表達產(chǎn)物同源，可以通過滅活和清除Bax家族成員來防止細(xì)胞發(fā)生凋亡或壞死。E1B55K基因產(chǎn)物可以下調(diào)p53基因的轉(zhuǎn)錄水平，當(dāng)然這種調(diào)節(jié)功能不是絕對的，其他一些腺病毒基因（如E4 orf6）也參與了這一過程。另外，E1B55K基因產(chǎn)物還與病毒復(fù)制、病毒晚期mRNA的轉(zhuǎn)錄以及病毒RNA的轉(zhuǎn)運有關(guān)?！ ?/p>
E2區(qū)基因表達產(chǎn)物
可分為E2A和E2B。其中，E2A即DNA結(jié)合蛋白（DBP，DNA Binding Protein）；E2B主要產(chǎn)物有兩種，分別是末端蛋白前體（pTP）和病毒DNA聚合酶（pol）。三種蛋白與至少三種細(xì)胞內(nèi)的因子相互作用，啟動腺病毒DNA復(fù)制以及病毒晚期基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯過程。
E3區(qū)基因表達產(chǎn)物
主要功能是破壞宿主的免疫防御機制，而與病毒基因組的復(fù)制無關(guān)。E3基因的產(chǎn)物之一11.6Kd，由于可以在病毒感染的晚期裂解細(xì)胞并釋放病毒顆粒而被稱為腺病毒死亡蛋白（ADP，adenovirus death protein）。gp 19K蛋白可以在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上與MHC I類分子的重鏈結(jié)合阻止其轉(zhuǎn)運到細(xì)胞表面，并且可以延緩MHC I的表達。RID α&β以及14.7Kd可以抑制由TNF誘發(fā)的細(xì)胞凋亡，促進Fas降解，下調(diào)TNF受體水平?！ ?/p>
E4區(qū)基因表達產(chǎn)物
E4區(qū)的基因產(chǎn)物通常被稱為orf 1~6/7，主要與病毒信使RNA的代謝有關(guān)。還有促進病毒DNA復(fù)制以及關(guān)閉宿主蛋白合成的功能。研究發(fā)現(xiàn)，一些E4產(chǎn)物可以與DNA激活的蛋白激酶結(jié)合，防止病毒DNA發(fā)生串聯(lián)。由于該激酶可以激活p53基因，因此可以認(rèn)為一些E4區(qū)基因產(chǎn)物可以抑制細(xì)胞凋亡。許多E1B和E4基因產(chǎn)物都與拮抗E1A蛋白功能有關(guān)。比如，E4 orf4抑制E1A對E2F啟動子的激活；E4 orf3VA RNA使一些由腺病毒轉(zhuǎn)錄的非翻譯RNA，與腺病毒抵抗宿主細(xì)胞免疫有關(guān)。
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