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核酸熱力學(xué)

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核酸熱力學(xué)是指溫度影響雙鏈DNA（dsDNA）的核酸結(jié)構(gòu)。DNA變性（DNA denaturation）又稱(chēng)DNA融化（DNA melting）是DNA雙螺旋解開(kāi)成為兩條單股長(zhǎng)鏈的過(guò)程。在過(guò)程中，使兩股長(zhǎng)鏈上的堿基相連的氫鍵會(huì)斷裂。 DNA的變性可以是溫度升高而產(chǎn)生的作用，也可能是其他化學(xué)物質(zhì)如尿素的誘導(dǎo)。使DNA解開(kāi)的融化溫度（Tm）是依DNA鏈的長(zhǎng)度，以及特定核苷酸序列的組成形式而定。

目錄

基礎(chǔ)概念

雜交

雜交是建立在兩個(gè)以上序列具有特異性相互作用的互補(bǔ)鏈之間產(chǎn)生非共價(jià)鍵結(jié)核酸成單一復(fù)合物，此種情況稱(chēng)為DNA雙股螺旋。寡核苷酸，DNA或RNA將在正常條件下綁定到其互補(bǔ)之序列，而使此互補(bǔ)鏈可以容易地與彼此結(jié)合。為了降低差異和獲得能量最高的優(yōu)選配合物，實(shí)驗(yàn)室中使用一種叫做退火的方法。然而，由于不同的核甘酸分子具有不同的幾何形狀，兩條鏈之間的差異不一會(huì)使它們之間具有較低的能量親和性來(lái)進(jìn)行結(jié)合。通過(guò)量化兩條鏈在退火之間的相似性可以提供堿基序列中溫度測(cè)量不相容效果的信息。該復(fù)合物可以通過(guò)熱解離來(lái)進(jìn)行變性，亦被稱(chēng)為融化，此法為將復(fù)合物溶液加熱，打破其核酸堿基對(duì)間的氫鍵，而使兩股分開(kāi)。在沒(méi)有外來(lái)的不利因素，雜交和融化的過(guò)程可以重復(fù)連續(xù)下去，其中配對(duì)方法可參考聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。最常見(jiàn)的是，核酸堿基對(duì)以A = T和G≡C的方式成對(duì)形成，其中后者是較穩(wěn)定的(由于氫鍵數(shù)較多)。

變性

DNA變性，又稱(chēng)DNA解鏈或融化，是由雙鏈去氧核糖核酸開(kāi)旋并通過(guò)斷裂分離成單鏈疏水且堆疊的單鏈分子?！白冃浴边€可以指DNA鏈的誘導(dǎo)化學(xué)物質(zhì)，如分離尿素。

DNA變性的方法亦可用于分析DNA的某些方面。因?yàn)?a href="/w/%E8%83%9E%E5%98%A7%E5%95%B6" title="胞嘧啶">胞嘧啶/鳥(niǎo)嘌呤堿基配對(duì)通常比腺嘌呤/胸腺嘧啶堿基配對(duì)更強(qiáng)，胞嘧啶和鳥(niǎo)嘌呤在一個(gè)基因組中（稱(chēng)為“GC含量 “），可以通過(guò)測(cè)量在該基因組DNA的熔解溫度來(lái)估計(jì)。[1]較高的溫度與GC含量高有關(guān)。由于GC含有三個(gè)氫鍵，而AT只具有兩個(gè)氫鍵。

DNA變性，也可用于檢測(cè)兩個(gè)不同的DNA序列之間之序列差異。將DNA加熱和變性成單鏈狀態(tài)，并將該混合物冷卻使可以重新進(jìn)行雜交。雜交分子的相似序列中如果互補(bǔ)序列有差異，則會(huì)導(dǎo)致堿基配對(duì)中斷。在基因組范圍中，該方法已被用于估算兩物種之間遺傳距離的研究，稱(chēng)為DNA-DNA雜交。[2] 在其中的單個(gè)分區(qū)的DNA，變性梯度凝膠和溫度梯度凝膠可用于檢測(cè)此兩個(gè)序列，此法稱(chēng)為溫度梯度凝膠電泳，為表現(xiàn)較小差異時(shí)使用的方法。[3][4]

DNA熔解的也應(yīng)用于分子生物學(xué)技術(shù)，特別是在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。盡管此技術(shù)不能診斷DNA熔化的溫度，所以估計(jì)（Tm）是確定來(lái)調(diào)整是和溫度是非常重要的。DNA的熔解溫度也可被用作用于均衡的一組分子的雜交優(yōu)勢(shì)，例如的寡核苷酸探針DNA微陣列。

退火

退火，在遺傳學(xué)中，用于單鏈的DNA或RNA的一互補(bǔ)序列由氫鍵形成配對(duì)的雙鏈多核苷酸。該術(shù)語(yǔ)通常用來(lái)描述一個(gè)的結(jié)合的DNA探針，或一個(gè)的結(jié)合的引物對(duì)DNA鏈中一個(gè)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。這個(gè)詞也經(jīng)常說(shuō)是蛋白質(zhì)，如RAD52可以幫助DNA退火。

兩種形態(tài)的熱力學(xué)

以下幾個(gè)公式用于計(jì)算（Tm）的值。[5][6]某些公式更精確地預(yù)測(cè)DNA雙鏈體的解鏈溫度。[7]對(duì)于DNA寡核苷酸，兩個(gè)型態(tài)的進(jìn)過(guò)程短的DNA序列能被準(zhǔn)確地雜交熱力學(xué)描述，假設(shè)兩個(gè)單鏈中間互相彼此結(jié)合成雙鏈的機(jī)率為100%之下，可以極簡(jiǎn)單地描述熱力學(xué)單鏈核酸A和B形成雙鏈核酸AB

AB ? A + B

該反應(yīng)的平衡常數(shù)為K=\frac{[A][B]}{[AB]}，根據(jù)范特霍夫等式，其自由能 ΔG, 和 K 是 ΔG° = -RTln K,其中R是理想氣體常數(shù)，T是該反應(yīng)的開(kāi)爾文溫度。此法適用于核酸系統(tǒng)。

\Delta G^\circ = -RT\ln\frac{[A][B]}{[AB]}.

于溫度達(dá)到（Tm）一半時(shí)解鏈就已經(jīng)開(kāi)始發(fā)生。如果沒(méi)有額外的核酸存在時(shí)，[A]，[B]和[AB]將是相等的，并且等于雙鏈核酸的初始濃度的一半。這給出了一個(gè)核酸雙鏈體的融點(diǎn)的表達(dá)式：

T_m = -\frac{\Delta G^\circ}{R\ln\frac{[AB]_{initial}}{2}}.

由于 ΔG° = ΔH° -TΔS°, Tm 也可以以下式表示：

T_m = \frac{\Delta H^\circ}{\Delta S^\circ-R\ln\frac{[AB]_{initial}}{2}}.

ΔH° and ΔS°通常為合作而非分解反應(yīng)，則演變成下式：[8]

T_m = \frac{\Delta H^\circ}{\Delta S^\circ+R\ln([A]_{total} - [B]_{total}/2)}, where [B]total < [A]total.

如上述所提到的，該方程是基于只有雙鏈和隨機(jī)卷曲兩種狀態(tài)參與了熔化的假設(shè)。然而，核酸還可以通過(guò)許多中間狀態(tài)的融化。考慮到這類(lèi)復(fù)雜的行為，必須結(jié)合統(tǒng)計(jì)力學(xué)，特別是長(zhǎng)序列相關(guān)的復(fù)合物。

此外還有 Wallace method For 15-20 nucleotides primers

   Tm = 2(A+T) + 4(G+C) ℃

從核酸序列推定熱力學(xué)性質(zhì)

上段表示了熔化溫度和熱力學(xué)參數(shù)都是相互關(guān)聯(lián)的(ΔG° or ΔH° & ΔS°)。從觀察熔化溫度中可以通過(guò)實(shí)驗(yàn)確定其熱力學(xué)參數(shù)。當(dāng)一個(gè)給定的核酸序列的熱力學(xué)參數(shù)是，熔融溫度即可以預(yù)測(cè)。對(duì)寡核苷酸而言，這些參數(shù)可以很好地通過(guò)最近鄰模型近似。

最近鄰近似法(Nearest-neighbor method)

在不同鏈之之間的相互作用一定程度上取決于相鄰堿基。最近鄰模型將DNA螺旋表示為“鄰近”的堿基對(duì)之間的相互作用的序列組。[8] 例如，下面所表示的DNA具有最接近由箭頭表示鄰相互作用。

    ↓ ↓ ↓ ↓ ↓
5' C-G-T-T-G-A 3'
3' G-C-A-A-C-T 5'

此DNA來(lái)自其自身之自由能ΔG于37℃時(shí)表示為

ΔG°37(理想) = ΔG°37(CG 最初) + ΔG°37(CG/GC) + ΔG°37(GT/CA) + ΔG°37(TT/AA) + ΔG°37(TG/AC) + ΔG°37(GA/CT) + ΔG°37(AT 最初)

第一項(xiàng)代表第一堿基對(duì)，CG的自由能，第二項(xiàng)包括形成第二個(gè)堿基對(duì)，GC的雙方的自由能，以此類(lèi)推。該堿基對(duì)產(chǎn)生與先前的堿基對(duì)之間的堆積作用。在一般情況下，形成的核酸雙鏈體的自由能總和以下式表示：

\Delta G_{37}^\circ (\mathrm{total}) = \Delta G_{37}^\circ (\mathrm{initiations}) + \sum_{i=1}^{10} n_i\Delta G_{37}^\circ (i).

上式亦可表達(dá)成以下形式：

\Delta G^\circ (\mathrm{total}) = \Delta H_{\mathrm{total}}^\circ - T\Delta S_{\mathrm{total}}^\circ.

ΔH° 和 ΔS°的值已經(jīng)確定至少有十個(gè)可能的相互作用。(表一)
表一. 1M NaCl的DNA / DNA雙鏈體最近鄰參數(shù)。[8]
最近鄰序列
(5'-3'/3'-5')		 ΔH°
千焦/莫耳		 ΔS°
焦耳/(莫耳·K)		 ΔG°37
千焦/莫耳
AA/TT ?33.1 ?92.9 ?4.26
AT/TA ?30.1 ?85.4 ?3.67
TA/AT ?30.1 ?89.1 ?2.50
CA/GT ?35.6 ?95.0 ?6.12
GT/CA ?35.1 ?93.7 ?6.09
CT/GA ?32.6 ?87.9 ?5.40
GA/CT ?34.3 ?92.9 ?5.51
CG/GC ?44.4 ?113.8 ?9.07
GC/CG ?41.0 ?102.1 ?9.36
GG/CC ?33.5 ?83.3 ?7.66
終端AT堿基對(duì) 9.6 17.2 4.31
終端的GC堿基對(duì) 0.4 ?11.7 4.05

表1所示的十個(gè)鄰居相關(guān)的參數(shù)是由短寡核苷酸的雙鏈熔解點(diǎn)確定的。特別的是，他們十組之中只有八組是獨(dú)立的。 最近鄰模型可以擴(kuò)展超出了華森克立克的配對(duì)，包括錯(cuò)配和鄰近堿基對(duì)之間相互作用的參數(shù)。[9]這使得含有孤立錯(cuò)配的序列具有熱力學(xué)參數(shù)的估計(jì)，例如像下列序列（箭頭表示不匹配）：

          ↓ ↓ ↓
5' G-G-A-C-T-G-A-C-G 3'
3' C-C-T-G-G-C-T-G-C 5'

參考文獻(xiàn)

  1. ↑ M. Mandel and J. Marmur. Use of Ultraviolet Absorbance-Temperature Profile for Determining the Guanine plus Cytosine Content of DNA. Methods in Enzymology. Methods in Enzymology. 1968, 12 (2): 198–206. doi:10.1016/0076-6879(67)12133-2. ISBN 978-0-12-181856-2. 
  2. ↑ C.G. Sibley and J.E. Ahlquist. The Phylogeny of the Hominoid Primates, as Indicated by DNA-DNA Hybridization. Journal of Molecular Evolution. 1984, 20 (1): 2–15. doi:10.1007/BF02101980. PMID 6429338. 
  3. ↑ R.M. Myers, T. Maniatis, and L.S. Lerman. Detection and Localization of Single Base Changes by Denaturing Gradient Gel Electrophoresis. Methods in Enzymology. Methods in Enzymology. 1987, 155: 501–527. doi:10.1016/0076-6879(87)55033-9. ISBN 978-0-12-182056-5. PMID 3431470. 
  4. ↑ T. Po, G. Steger, V. Rosenbaum, J. Kaper, and D. Riesner. [http//www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC305948/ Double-stranded cucumovirus associated RNA 5: experimental analysis of necrogenic and non-necrogenic variants by temperature-gradient gel electrophoresis]. Nucleic Acids Research. 1987, 15 (13): 5069–5083. doi:10.1093/nar/15.13.5069. PMID 3601667. PMC 305948. 
  5. ↑ Breslauer, K.J. et al.; Frank, R; Bl?cker, H; Marky, LA. [http//www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC323600/ Predicting DNA Duplex Stability from the Base Sequence]. Proc. Natl. Acad. Sci. USA.. 1986, 83 (11): 3746–3750. doi:10.1073/pnas.83.11.3746. PMID 3459152. PMC 323600.  (pdf)
  6. ↑ Rychlik, W.; Spencer, W. J.; Rhoads, R. E.. [http//www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC332522/ Optimization of the annealing temperature for DNA amplification in vitro]. Nucleic Acids Res.. 1990, 18 (21): 6409–6412. doi:10.1093/nar/18.21.6409. PMID 2243783. PMC 332522. 
  7. ↑ Owczarzy R., Vallone P.M., Gallo F.J., Paner T.M., Lane M.J. and Benight A.S. Predicting sequence-dependent melting stability of short duplex DNA oligomers. Biopolymers. 1997, 44 (3): 217–239. doi:10.1002/(SICI)1097-0282(1997)44:3<217::AID-BIP3>3.0.CO;2-Y. PMID 9591477.  (pdf)
  8. ↑ 8.0 8.1 8.2 John SantaLucia Jr.. [http//www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC19045/ A unified view of polymer, dumbbell, and oligonucleotide DNA nearest-neighbor thermodynamics]. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998, 95 (4): 1460–5. doi:10.1073/pnas.95.4.1460. PMID 9465037. PMC 19045. 
  9. ↑ John SantaLucia Jr., John; Donald Hicks. The thermodynamics of DNA structural motifs. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. June 2004, 33: 415–440 [27 March 2013]. doi:10.1146/annurev.biophys.32.110601.141800. PMID 15139820. 

參見(jiàn)

外部連結(jié)

蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)
核酸結(jié)構(gòu)
另見(jiàn)

參考來(lái)源

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